რეალურ დროში ფლუორესცენციის რაოდენობრივი PCR არის პროდუქტის მთლიანი რაოდენობის გაზომვის მეთოდი პოლიმერაზული ჯაჭვური რეაქციის (PCR) ყოველი ციკლის შემდეგ დნმ-ის ამპლიფიკაციის რეაქციაში ფტორფორის გამოყენებით.მეთოდი გამოიყენება დნმ-ის სპეციფიკური თანმიმდევრობების რაოდენობრივი დასადგენად ნიმუშში შესამოწმებლად შიდა ან გარე საცნობარო მეთოდებით.დაარსების დღიდან, ფლუორესცენტური რაოდენობრივი PCR ანალიზები სულ უფრო პოპულარული გახდა ლაბორატორიის მასწავლებლებში.
Fluorescence PCR პრინციპი: Fluorescence PCR, რომელსაც ჯერ TaqManPCR და მოგვიანებით Real-TimePCR უწოდეს, არის ნუკლეინის მჟავების რაოდენობრივი განსაზღვრის ახალი ტექნიკა, რომელიც შემუშავებულია PE (PerkinElmer) მიერ აშშ-ში 1995 წელს. ტექნიკა დაფუძნებულია ფლუორესცენტურად მარკირებული ზონდის ან შესაბამისი ზონდის დამატებაზე. ფლუორესცენტური საღებავი ჩვეულებრივი PCR-ზე მისი რაოდენობრივი ფუნქციის მისაღწევად.პრინციპი: როგორც PCR რეაქცია მიმდინარეობს, PCR რეაქციის პროდუქტები გროვდება და ფლუორესცენტური სიგნალის ინტენსივობა იზრდება თანაბარი პროპორციით.ყოველი ციკლის დროს გროვდება ფლუორესცენციის ინტენსივობის სიგნალი, რათა ჩვენ შეგვიძლია დავაკვირდეთ პროდუქტის ოდენობის ცვლილებას ფლუორესცენციის ინტენსივობის ცვლილებით და ამით მივიღოთ ფლუორესცენციის გაძლიერების მრუდის გრაფიკი.
ზოგადად, ფლუორესცენციის გამაძლიერებელი მრუდი შეიძლება დაიყოს სამ ფაზად: ფლუორესცენციის ფონის სიგნალის ფაზა, ფლუორესცენციის სიგნალის ექსპონენციალური გაძლიერების ფაზა და პლატოს ფაზა.ფონური სიგნალის ფაზაში, გაძლიერებული ფლუორესცენტური სიგნალი დაფარულია ფლუორესცენციის ფონის სიგნალით და პროდუქტის ოდენობის ცვლილებების დადგენა შეუძლებელია.პლატოს ფაზაში, გამაძლიერებელი პროდუქტი აღარ იზრდება ექსპონენტურად, არ არსებობს წრფივი კავშირი საბოლოო პროდუქტის რაოდენობასა და საწყისი შაბლონის რაოდენობას შორის და საწყისი დნმ-ის ასლის ნომერი არ შეიძლება გამოითვალოს საბოლოო PCR პროდუქტის რაოდენობაზე დაყრდნობით.მხოლოდ ფლუორესცენტური სიგნალის ექსპონენციალური გაძლიერების ფაზაში არის წრფივი კავშირი PCR პროდუქტის ოდენობის ლოგარითმსა და საწყისი შაბლონის რაოდენობას შორის, და ჩვენ შეგვიძლია ავირჩიოთ რაოდენობრივი შეფასება ამ ეტაპზე.რაოდენობრივი და შედარების მოხერხებულობისთვის, რეალურ დროში ფლუორესცენტური რაოდენობრივი PCR ტექნიკაში დაინერგა ორი ძალიან მნიშვნელოვანი კონცეფცია: ფლუორესცენციის ბარიერი და CT მნიშვნელობა.
ბარიერი არის ხელოვნურად დაყენებული მნიშვნელობა ფლუორესცენციის გაძლიერების მრუდზე.PCR გაძლიერების ექსპონენციალური ფაზა.
Ct მნიშვნელობა: არის ციკლების რაოდენობა, რომელიც გაიარა ფლუორესცენციულმა სიგნალმა თითოეულ რეაქციის მილში, რათა მიაღწიოს დადგენილ დომენის მნიშვნელობას.
ურთიერთობა Ct მნიშვნელობასა და საწყის შაბლონს შორის: კვლევებმა აჩვენა, რომ თითოეული შაბლონის Ct მნიშვნელობა აქვს წრფივი კავშირი ამ შაბლონის საწყისი ასლის ნომრის ლოგარითმთან, რაც უფრო მეტია საწყისი ასლის ნომერი, მით უფრო მცირეა Ct. ღირებულება.Ct მნიშვნელობები შედარებით სტაბილურია.სტანდარტული მრუდი შეიძლება გაკეთდეს სტანდარტის გამოყენებით ცნობილი საწყისი ასლის ნომრით, სადაც ჰორიზონტალური კოორდინატი წარმოადგენს საწყისი ასლის ნომრის ლოგარითმს და ვერტიკალური კოორდინატი წარმოადგენს Ct მნიშვნელობას, როგორც ნაჩვენებია ქვემოთ მოცემულ ფიგურაში.
ამრიგად, უცნობი ნიმუშის Ct მნიშვნელობის მიღებით, ამ ნიმუშის საწყისი ასლის ნომერი შეიძლება გამოითვალოს სტანდარტული მრუდით.
Ct მნიშვნელობა არ არის მუდმივი და მასზე შეიძლება გავლენა მოახდინოს სხვადასხვა ნიმუშებმა და სხვადასხვა ინსტრუმენტებმა, მაშინაც კი, თუ ერთი და იგივე ნიმუში 2-ჯერ განმეორდება ერთსა და იმავე ინსტრუმენტზე, Ct მნიშვნელობა შეიძლება განსხვავდებოდეს.
რაოდენობრივი ფლუორესცენტური ანალიზები: რაოდენობრივი ფლუორესცენტური ანალიზები შეიძლება დაიყოს ფლუორესცენტულ ზონდებად და ფლუორესცენტულ საღებებად, გამოყენებული მარკერების მიხედვით.ფლუორესცენტური ზონდები მოიცავს Beacon ტექნოლოგიას (მოლეკულური შუქურის ტექნოლოგია, წარმოდგენილი ამერიკული Tagyi), TaqMan ზონდები (წარმოდგენილი ABI-ს მიერ) და FRET ტექნოლოგია (წარმოდგენილია Roche-ს მიერ);ფლუორესცენტური საღებავები მოიცავს გაჯერებულ ფლუორესცენტულ საღებავებს და არაგაჯერებულ ფლუორესცენტულ საღებავებს, არაგაჯერებული ფლუორესცენტური საღებავების ტიპიური წარმომადგენელია SYBRGreen I, რომელიც ახლა ჩვეულებრივ გამოიყენება;გაჯერებული არაგაჯერებული ფლუორესცენტური საღებავების ტიპიური წარმომადგენელია SYBRGreenⅠ;გაჯერებული ფლუორესცენტური საღებავებია EvaGreen, LCGreen და ა.შ.
SYBRGreenI არის ხშირად გამოყენებული დნმ-ის დამაკავშირებელი საღებავი ფლუორესცენტური PCR-ისთვის, რომელიც არასპეციფიკურად უკავშირდება ორჯაჭვიან დნმ-ს.თავისუფალ მდგომარეობაში, SYBRGreenI ასხივებს სუსტ ფლუორესცენციას, მაგრამ ორჯაჭვიან დნმ-თან დაკავშირების შემდეგ მისი ფლუორესცენცია 1000-ჯერ იზრდება.მაშასადამე, რეაქციის შედეგად გამოსხივებული მთლიანი ფლუორესცენტური სიგნალი პროპორციულია ორჯაჭვიანი დნმ-ის ოდენობის პროპორციულად და იზრდება გამაძლიერებელი პროდუქტის მატებასთან ერთად.
ორჯაჭვიანი დნმ-ის დამაკავშირებელი საღებავების უპირატესობები: მარტივი ექსპერიმენტული დიზაინი, საჭიროა მხოლოდ 2 პრაიმერი, არ არის საჭირო ზონდების დიზაინი, არ არის საჭირო მრავალი ზონდის დაპროექტება მრავალი გენის სწრაფი ტესტირებისთვის, დნობის წერტილის მრუდის ანალიზის შესრულების უნარი, ტესტის სპეციფიკა. გამაძლიერებელი რეაქცია, დაბალი საწყისი ღირებულება, კარგი განზოგადება და, შესაბამისად, უფრო ხშირად გამოიყენება კვლევებში სახლში და მის ფარგლებს გარეთ.
ფლუორესცენტური ზონდის მეთოდი (Taqman ტექნიკა): როდესაც PCR გაძლიერება ხორციელდება, პრაიმერების წყვილი ემატება სპეციფიკურ ფლუორესცენტურ ზონდს.როდესაც ზონდი ხელუხლებელია, რეპორტიორის ჯგუფის მიერ გამოსხივებული ფლუორესცენციის სიგნალი შეიწოვება ჩამქრალი ჯგუფის მიერ და არ არის გამოვლენილი PCR ინსტრუმენტის მიერ;PCR გაძლიერების დროს (გაფართოების ფაზაში), Taq ფერმენტის 5'-3' გაყოფის აქტივობა არღვევს ზონდს ფერმენტულად, რაც ქმნის რეპორტიორის ფლუორესცენციულ ჯგუფს და ჩაქრებულ ფლუორესცენციულ ჯგუფს.
ფლუორესცენტური რაოდენობრივი PCR-ის გამოყენება.
მოლეკულური ბიოლოგიის კვლევა:
1. ნუკლეინის მჟავის რაოდენობრივი ანალიზი.ინფექციური დაავადებების რაოდენობრივი და ხარისხობრივი ანალიზი, პათოგენური მიკროორგანიზმების ან ვირუსების გამოვლენა, როგორიცაა ბოლო გრიპის A (H1N1) ეპიდემია, ტრანსგენური მცენარეების და ცხოველების გენის ასლების რაოდენობის აღმოჩენა, RNAi გენის ინაქტივაციის სიჩქარის გამოვლენა და ა.შ.
2. დიფერენციალური გენის ექსპრესიის ანალიზი.გენის ექსპრესიის განსხვავებების შედარება დამუშავებულ ნიმუშებს შორის (მაგ. წამლის მკურნალობა, ფიზიკური მკურნალობა, ქიმიური მკურნალობა და ა.შ.), სპეციფიკური გენების ექსპრესიის განსხვავებები სხვადასხვა ფაზაში და cDNA მიკრომასია ან დიფერენციალური გამოხატვის შედეგების დადასტურება
3. SNP გამოვლენა.ერთი ნუკლეოტიდური პოლიმორფიზმის გამოვლენა მნიშვნელოვანია სხვადასხვა დაავადებებისადმი ინდივიდუალური მიდრეკილების ან კონკრეტული მედიკამენტებისადმი ინდივიდუალური პასუხის შესასწავლად და მოლეკულური შუქურების გენიალური სტრუქტურის გამო, როდესაც ცნობილია SNP-ის თანმიმდევრობის ინფორმაცია, ადვილი და ზუსტია. გამოიყენეთ ეს ტექნიკა მაღალი გამტარუნარიანობის SNP გამოვლენისთვის.
4. მეთილაციის გამოვლენა.მეთილაცია დაკავშირებულია ადამიანის ბევრ დაავადებასთან, განსაკუთრებით კიბოსთან, და ლაირდმა მოახსენა ტექნიკა სახელწოდებით Methyllight, რომელიც მკურნალობს დნმ-ს ამპლიფიკაციამდე ისე, რომ არამეთილირებული ციტოზინი იქცევა ურაცილამდე, ხოლო მეთილირებული ციტოზინი ზემოქმედებას არ განიცდის. .უფრო მგრძნობიარე.
Სამედიცინო გამოკვლევა:
1. პრენატალური დიაგნოსტიკა: ადამიანებს არ შეუძლიათ განკურნონ მემკვიდრეობითი დაავადებები, რომლებიც გამოწვეულია შეცვლილი გენეტიკური მასალისგან და ჯერჯერობით, მათ შეუძლიათ მხოლოდ პრენატალური მონიტორინგის გზით დაბადებული ავადმყოფი ბავშვების რაოდენობის შემცირება, რათა თავიდან აიცილონ სხვადასხვა მემკვიდრეობითი დაავადებები.ეს არის არაინვაზიური მეთოდი, რომელიც ადვილად მისაღებია ორსული ქალების მიერ.
2. პათოგენის გამოვლენა: ფლუორესცენტური რაოდენობრივი PCR ანალიზი იძლევა პათოგენების რაოდენობრივ განსაზღვრას, როგორიცაა გონოკოკი, Chlamydia trachomatis, Mycoplasma solium, ადამიანის პაპილომა ვირუსი, ჰერპეს სიმპლექსის ვირუსი, ადამიანის იმუნოდეფიციტის ვირუსი, ჰეპატიტის ვირუსი, გრიპის ტუბერკულოზის ვირუსი, გრიპის ტუბერკულოზი.მას აქვს მაღალი მგრძნობელობის, ნიმუშის დაბალი ზომის, სისწრაფისა და სიმარტივის უპირატესობა ტრადიციულ ტესტირების მეთოდებთან შედარებით.
3. წამლის ეფექტურობის შეფასება: B ჰეპატიტის ვირუსის (HBV) და C ჰეპატიტის ვირუსის (HCV) რაოდენობრივი ანალიზი აჩვენებს, რომ კავშირი ვირუსულ დატვირთვასა და გარკვეული მედიკამენტების ეფექტურობას შორის.თუ HBV-დნმ-ის დონე შრატში მცირდება ლამივუდინის მკურნალობის დროს და შემდეგ კვლავ იზრდება ან აჭარბებს წინა დონეს, ეს მიუთითებს ვირუსის მუტაციაზე.
4. ონკოგენეტიკური ტესტირება: მიუხედავად იმისა, რომ სიმსივნის განვითარების მექანიზმი ჯერ კიდევ არ არის ნათელი, საყოველთაოდ მიღებულია, რომ შესაბამისი გენების მუტაციები არის ონკოგენური ტრანსფორმაციის გამომწვევი მიზეზი.ონკოგენების გაზრდილი ექსპრესია და მუტაცია შეიძლება შეინიშნოს მრავალი სიმსივნის ადრეულ სტადიაზე.რეალურ დროში ფლუორესცენციული რაოდენობრივი PCR არა მხოლოდ ეფექტურია გენებში მუტაციების გამოვლენაში, არამედ შეუძლია ზუსტად აღმოაჩინოს ონკოგენების ექსპრესია.ეს მეთოდი გამოიყენებოდა სხვადასხვა გენის ექსპრესიის გამოსავლენად, მათ შორის ტელომერაზას hTERT გენის, ქრონიკული გრანულოციტური ლეიკემიის WT1 გენის, ონკოგენური ER გენის, პროსტატის კიბოს PSM გენის და სიმსივნესთან ასოცირებული ვირუსული გენების გამოსავლენად.
ითარგმნა www.DeepL.com/Translator-ით (უფასო ვერსია)
გამოქვეყნების დრო: ივნისი-21-2022